[漳州水仙花网][返回首页][打印本页][打印选项]
中国水仙花生物技术研究进展概况

中国水仙花生物技术研究进展概况 
 
    水仙花(Narcissus)是石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物,有许多变种和亚种,原产北非、中欧及地中海沿岸,并从地中海沿岸一直延伸到亚洲,到达中国及朝鲜、日本。水仙花以其素雅清香闻名,在世界花卉产业中有着重要地位。随着生物技术的发展和不断完善,细胞工程和基因工程等广泛应用于水仙花的研究,并取得重要突破。1离体植株再生

20世纪70年代初,Stone等以水仙花(Narcissus tazetta cv Grand Soleil d'Or)为材料进行离体脱毒技术研究,这是水仙花离体植株再生成功的首例报道。此后,水仙花离体植株再生的相关研究不断深入,尤其是以低温预处理打破水仙花休眠来提高小鳞芽的诱导。Chen等研究表明,黑暗条件下,30℃储藏的母球转至15℃预处理42d,可打破水仙花(Narcissus tazetta cv.‘Ziva’)的休眠状态。中国水仙(Narcissus tazetta vat. chinensis)低温预处理的温度研究集中在4~10℃左右。陈振光发现漳州水仙和平潭水仙经过低温预处理28~70d较为适合,而王国明等认为普陀水仙低温预处理应控制在28~63d内,袁学军等确认了42d左右是普陀水仙最佳的低温预处理时间。陆春芳等证实,至少42d以上的低温预处理才有助于崇明水仙高频诱导小鳞茎。上述结果表明,基因型在一定程度上决定了水仙花离体植株再生低温预处理条件甚至是休眠状态和再生能力,Sochacki等和Squires等的研究结果也证明了这一结论。

1.1直接器官发生途径

1.1.1外植体 通过直接器官发生途径,且前已成功用于水仙花植株再生的外植体主要有鳞茎盘、鳞片、子房等。其中以鳞茎盘为外植体的方法已发展为一种较成熟的发生体系。相关研究表明,不同栽培品种的中国水仙鳞茎盘再生成功的关键在于尽量保证切块的双鳞片间或鳞片外侧有大量的芽原基,进而诱导小鳞茎再生。而王俐掣心J研究表明,漳州水仙带鳞茎盘鳞片、中部鳞片及上部鳞片均可诱导出小鳞茎。陈振光等证实,漳州水仙花蕾横切成薄片也可诱导小鳞茎再生。Lu以中国水仙花被为外植体,成功诱导了花被器官的再生。但陆春芳等∞J以崇明水仙花梗为外植体,结果未能诱导形成小鳞茎。可见外植体的部位是影响中国水仙成功诱导小鳞茎再生的重要因素。

1.1.2培养基 对于基本培养基的筛选,袁学军等蟑’选择改良的MS,曾荣华等则选择MS/N6。而陈振光等在比较基本培养基对小鳞茎诱导效果的试验中选用了Morel基本培养基,并设计了“中华培养基”;同时还发现翅仔(一年生)诱导小鳞茎的效果好于商品球茎,适宜接种期为3、9、10月份。

1.1.3激素 激素是影响外植体分化的重要因素。水仙花小鳞茎的高频率发生也需要一定浓度的激素或激素组合。Santos等认为,茉莉酸(JA)在水仙花(Narcissus triandrus)小鳞茎形成和膨大过程中起着重要作用。李招文等认为,漳州水仙花鳞茎盘在一定浓度的NAA作用下可以逐渐发育成小鳞茎;但曾宪宝等研究表明,中国水仙鳞茎盘在不含外源激素的MS培养基上也可以逐渐发育成小鳞茎。这可能是因为水仙花鳞茎盘储藏着极其丰富的养分,在适宜的条件下易诱导芽的分化。但相关研究表明,鳞茎盘诱导小鳞茎以一定浓度的分裂素和生长素组合为佳。鉴于特殊的结构和较少的养分,鳞片诱导小鳞茎对激素的要求更加严格。王俐等研究表明3.0mg/L BA和0.01mg/L NAA适合漳州水仙鳞片诱导。可见水仙花鳞片诱导小鳞茎再生需要较高浓度分裂素和低浓度生长素组合。Seabrook等研究表明,10.0mg/L BA和1.0mg/L NAA组合可诱导水仙花(daffodil and narcissus)子房组织分化小鳞芽;陈振光等试验表明,漳州水仙子房切片在5.0mg/L BA+2.0mg/L NAA组合中可诱导小鳞茎再生。

1.1.4糖类及附加物 Staikidou等研究表明,单独选用蔗糖、葡萄糖、果糖或等质量浓度的葡萄糖与果糖混合物等可溶性糖类可促进水仙花(Narcissus cv st.Keverne and Hawera)小鳞茎的形成。Selles认为,9%(w/v)蔗糖的液体培养基中水仙花(Narcissus confusus)丛生芽形成效果最好。因此,同一基因型水仙花小鳞茎的形成受糖的类型的直接影响,不同基因型水仙花小鳞茎的形成所需糖的浓度也有差异。而陆春芳等和郑春明认为附加一定浓度的水解络蛋白和硝酸银有利于诱导小鳞茎再生。

1.1.5其它条件  Hol等在研究水仙花(Narcissus pseudonarcisus ‘Golden Harvest’)外植体的污染问题时发现,热水处理后再用次氯酸钠溶液消毒能使双鳞片污染率降低5%,可能是菌类分布在鳞茎组织内部的缘故。Sochacki等发现水仙花(Narcissus pseudonarcissus‘Carlton’, ‘Heweliusz’)外植体用O.1%升汞消毒的污染率较0.75%氯胺消毒降低3%。

1.2间接器官发生途径

    愈伤组织诱导与小鳞茎再生是水仙花生物技术研究的重要工作,但目前相关研究进展有限,初步推测可能是水仙花在休眠期间积累了大量的养分,休眠被打破后其预分化的生理机能被有效激发,使得通过外源激素等因素加以调控而抑制其直接器官发生并诱导形成愈伤组织的难度增加。水仙花愈伤组织培养研究的相关报道详见表1。

从表l可见:(1)诱导愈伤组织的外植体来源丰富,包括带部分鳞片的鳞茎盘或带部分鳞茎盘的鳞片、花梗、未抽葶花序、花药、子房、幼嫩叶片以及成熟的种子等;(2)影响水仙花脱分化的主要激素组合是2,4-D+BA、NAA+BA、2,4-D、BA及NAA等。但水仙花愈伤组织培养也存在一些问题:(1)愈伤组织总体再分化率较低;(2)再分化的愈伤组织繁殖系数不高;(3)愈伤组织的继代增殖成为众多研究中的瓶颈;(4)仅少数水仙花品种成功诱导出胚性愈伤组织,中国水仙还未见报道。

l.3体细胞胚发生途径

    目前已建立了两种不同外植体来源的水仙花体细胞胚发生的技术体系,一是水仙花(Narcissus confusus)成熟种子培养诱导胚性愈伤组织,并在初代培养基上继续培养后获得体细胞胚和小鳞芽,小鳞芽在MS+5.0mg/L BA+lmg/L 2,4-D的培养基上可大量增生;二是通过水仙花(Narcissus pseudonarcissus‘Golden Harvest’and‘st.Keverne')花柄在改良的MS基本培养基上培养诱导幼小的体细胞胚,直接发生的体细胞胚可以再生完整的植株瞄引。然而,水仙花体细胞胚发生的研究还处于起步阶段,技术方法很不成熟,一些品种的体细胞胚发生研究仍是空白,包括三倍体的中国水仙。

 


2相关基因克隆

水仙花变种和亚种多样,因此也蕴涵着许多有意义的目的基因。Schledz等克隆了水仙花(Narcissus pseudonarcissus)八番茄红素合成酶基因(PSY),并成功地实现其在水稻(Oryza sativa)胚乳中表达。这是水仙花相关基因克隆的首例报道,而培育出的新型转基因水稻“金米”原维生素 A的含量比传统水稻提高了20多倍。此后,克隆水仙花不同目的基因的研究逐渐丰富,包括花色基因、花型基因及衰老相关基因(Senescence-associated gene)等。黄胤怡以即将开放的中国水仙花蕾为材料,利用PT-PCR方法克隆查尔酮合酶基因(CHS)的cDNA,构建了在植物中表达CHS的植物双元表达载体p1301B OC。邹清成瞄驯从中国水仙花瓣中分离得到反义PSY基因的572bp片段,将该片段反向连接到pCAMBIAl301双元载体质粒上,得到CaMV 35S组成型启动子的表达载体,并对中国水仙进行了遗传转化研究,获得转基因抗性芽。汪政科从中国水仙中克隆了对花形态发育有重要调控作用的Agamous同源基因,奠定了中国水仙花型遗传改良的基础。Hunter等以水仙花的一个栽培品种(Narcissus pseudonarcissus‘Dutch Master’)为研究材料,应用聚合酶链反应(PCR)技术研究衰老相关基因在水仙花中的表达。水仙花相关目的基因的克隆,有利于不同基因型水仙花丰富的基因资源进一步开发与利用。但目前水仙花基因克隆工作还存在一些不足:(1)基于不同遗传改良方向的目的基因种类少,仅有花色、花型和衰老相关基因;(2)克隆操作过程中仅获得相关目的基因的cDNA片段。

3遗传转化

    随着遗传操作技术的日益成熟,水仙花尤其是中国水仙的遗传转化研究也逐渐升温。目前关于中国水仙遗传转化方法的研究已取得一些进展(表2),主要有以下特点:(1)受体系统相对单一,以鳞茎盘为主;(2)均用农杆菌介导法,为农杆菌成功浸染单子叶植物提供了有力证据;(3)为提高vir区基因的活化程度,均添加AS(乙酰丁香酮)等农杆菌活化物;(4)主要选择潮霉素进行抗性筛选;(5)遗传转化的方向主要围绕改变花色、提高抗性和延缓衰老等方面,但转化频率低或为零。此外,在转化植株检测过程中,多数只检测到GUS报告基因的表达而没有目的基因的确定表达。因此,对于中国水仙遗传转化仍需系统深入研究,特别是对于中国水仙花期短的问题。


4水仙花生物技术的应用

水仙花具有独特的观赏价值,体内含有丰富的生物碱。生物技术在水仙花脱毒快繁、品种改良、种质资源保存以及次生物质生产等方面有广阔的应用空间。栾爱业等[43’在总结中国水仙生物技术研究进展中也详细讨论了分子标记技术在中国水仙上的应用。水仙花分球繁殖率较低且易退化,抗病性差,易感染病毒且感染速度快,而应用组织培养可有效地克服这些弊端,达到脱毒快繁的良好效果。此外,水仙花离体突变体筛选技术、原生质体培养与细胞融合、遗传转化技术也广泛应用,包括延缓衰老、延长花期、抗逆性、抗病虫害、改变花型及花色等方面。随着生物技术的多栖发展,分子标记技术也应用于水仙花亲缘关系及遗传多样性研究,这对水仙花种质资源保存有重要意义。此外,生物技术在水仙花次生代谢物质生产上也有着广泛的应用,包括水仙花生物碱、蛋白质、糖、酶、色素及高级香精的生产等方面。

5存在问题及展望

    目前水仙花生物技术在细胞工程和基因工程中的应用都取得了一系列的进展,但适合基因转化的植株再生体系和转化技术仍不成熟,将其应用于培育抗病、抗逆性新品种仍存在许多困难,具体表现在:(1)高频率再生体系仍缺乏优良的构建方法;(2)单倍体遗传育种的研究空间极大;(3)体细胞元性系变异以及突变体筛选程度不够;(4)成功的细胞悬浮培养研究空缺;(5)原生质体培养只是涉及到原生质体再生细胞团,而对于原生质体再生植株以及原生质体融合等的具体研究都是未知数;(6)遗传转化等方面行之有效的技术体系仍需深入探讨;(7)丰富的目的基因克隆技术有待进一步展开;(8)实际生产中仍未真正应用生物技术选育新品种。

    随着全球水仙花生物技术的不断发展,结合未来世界园艺产业的发展,应用生物技术进行水仙花的新品种研发将是该领域的研究方向,从而使生物技术真正为水仙花产业化发展开辟更为广阔的途径。

《亚热带植物科学》2007.36(3):74-79

黄双龙,赖钟雄

(福建农林大学园艺植物生物工程研究所,福建福州350002)